Laboratorio

Il Laboratorio di Biofisica e Fisiologia dei Neuroni Corticali è stato istituito nel 1999 all’arrivo del Dott. Magistretti al Dipartimento di Scienze Fisiologiche-Farmacologiche Cellulari-Molecolari (oggi Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani") dell’Università di Pavia.

L’attività di questo laboratorio è incentrata sullo studio di correnti ioniche di membrana implicate nella determinazione delle proprietà eccitabili intrinseche dei neuroni della corteccia cerebrale e importanti nelle funzioni di integrazione e codifica dei segnali. Da un lato, vengono indagate le proprietà biofisiche e le basi di singolo canale di tali correnti; dall’altro, ne vengono studiati i ruoli e le reciproche interazioni nella generazione dei quadri di attività elettrica espressi dai neuroni corticali in specifici stati funzionali.

Le indagini condotte in questo laboratorio sono quindi di tipo elettrofisiologico, e vengono realizzate applicando la tecnica del patch clamp su diversi preprati neuronali. Il patch clamp è una potente tecnica elettrofisiologica che permette sia di rilevare correnti ioniche generate a livello di singola cellula o di singolo canale ionico, sia di iniettare nella cellula ioni, proteine, farmaci. Nel laboratorio sono attualmente in funzione due setup di patch clamp, di cui uno per gli esperimenti su fettine di tessuto cerebrale e uno per le registrazioni su neuroni isolati.

Le linee di ricerca attualmente o recentemente seguite in questo laboratorio sono:

1) Studio degli effetti di cationi metallici divalenti sulle proprietà biofisiche e funzionali di canali voltaggio-dipendenti neuronali. Questa linea di ricerca è germinata da un precedente lavoro sugli effetti esercitati dagli ioni nichel sulle correnti del calcio ad alta soglia nei neuroni paleocorticali (Magistretti et al., 2001). In tale studio è stato mostrato come il nichel, oltre a esercitare un effetto di blocco sui canali ad alta soglia, ne modifica anche le cinetiche di gating sia in attivazione sia in deattivazione. Tale studio è stato esteso agli ioni zinco (Magistretti et al., 2003a) il cui fisiologico ruolo di cotrasmettitore e neuromodulatore di canali ionici sinaptici e non sinaptici è ben noto, e a diversi altri cationi metallici divalenti (Castelli et al., 2003). L’analisi biofisica ha permesso di risalire a un modello dell’interazione catione-canale in cui il legame del catione bloccante ha come ulteriore risultato un rallentamento delle cinetiche di gating fra stati chiusi e stati aperti. Tali effetti potrebbero avere un significativo ruolo funzionale come meccanismo di modulazione, da parte dello zinco rilasciato sinapticamente, dei canali del calcio presenti sui terminali presinaptici.
Recentemente è stato condotto uno studio sugli effetti degli ioni zinco sui canali voltaggio-dipendenti del sodio in neuroni di corteccia entorinale (Nigro et al., 2011). Tale studio ha evidenziato la capacità dello zinco di modificare le proprietà di gating dei canali del sodio neuronali agendo in modo differenziale sul processo di attivazione-deattivazione e su quello di inattivazione, a indicare l'esistenza di una parziale indipendenza dei due processi.

2) Studio delle correnti voltaggio-dipendenti di sodio attive sotto soglia o intorno alla soglia. Questa linea di ricerca discende dall’attività svolta dal Dott. Magistretti fra il 1997 e il 2000 presso il laboratorio del Prof. Angel Alonso al Montreal Neurological Institute, McGill University, Montréal, Canada, nello studio delle proprietà biofisiche e di singolo canale della corrente di sodio persistente (INaP) nei neuroni della corteccia entorinale. In queste cellule la INaP è stata caratterizzata prima a livello di whole cell (Magistretti & Alonso, 1999), poi di singolo canale (Magistretti et al., 1999a, 1999b; Magistretti & Alonso, 2002; Magistretti et al., 2003b; Magistretti & Alonso, 2007). Ne è stato quindi ricostruito il ruolo nel sostenere oscillazioni sotto soglia di banda theta del potenziale di membrana in concerto con la corrente cationica attivata in iperpolarizzazione, Ih (Dickson, Magistretti et al., 2000; Fransén et al., 2004): questo ha rappresentato il primo caso descritto di interazione fra INaP e Ih come meccanismo sufficiente per la genesi di oscillazioni intrinseche del potenziale di membrana.
Sono state poi indagate a fondo le proprietà della corrente di sodio risorgente (INaR) nei neuroni del sistema ippocampo-parippocampale (Castelli et al., 2007a, 2007b). La INaR è una componente di più recente identificazione della corrente neuronale di sodio, caratterizzata dall'insolita proprietà di attivarsi in ripolarizzazione (Raman & Bean, 1997). L'espressione di livelli particolarmente elevati di INaR nelle cellule stellate dello strato II della corteccia entorinale (Castelli et al., 2007b) ne suggerisce un importante ruolo funzionale in questi neuroni, lo studio del quale è attualmente in corso.
L’indagine sulle correnti di sodio attive sotto soglia o intorno alla soglia è stata estesa anche alle cellule granulari del cervelletto. In collaborazione con il Prof. Egidio D’Angelo sono state caratterizzate le proprietà biofisiche e funzionali delle diverse componenti della corrente di sodio presente in tali neuroni (fra cui la INaP e la INaR), ne sono stati ricostruiti i ruoli funzionali, ed è stata indagata la localizzazione subcellulare dei sottostanti canali, anche attraverso un approccio modellistico (Magistretti et al., 2006; Diwakar et al., 2009). In collaborazione con il gruppo del Prof. Patrick Delmas dell'Università di Marsiglia, le basi molecolari di queste correnti sono state studiate attraverso l'uso di un topo knock out condizionale per la subunità Nav1.6, nel quale l'espressione del corrispondente gene è selettivamente soppressa nelle cellule granulari (Osorio et al., 2010).

3) Studio dei meccanismi di modulazione muscarinica dell’eccitabilità nei neuroni della corteccia entorinale. La nostra recente attività sperimentale ha rivelato che, in presenza di stimolazione colinergica, i neuroni della corteccia entorinale modificano radicalmente la propria attività di scarica generando, in seguito all’applicazione di stimoli depolarizzanti sopra soglia, potenziali depolarizzanti postumi (DAP) e scariche postume di potenziali d’azione (afterdischarge) le quali possono a loro volta sfociare in un’attività di bursting ritmico spontaneo a bassa frequenza. Abbiamo inoltre dimostrato come questi fenomeni dipendono dall’induzione, da parte dello stimolo colinergico, di una corrente depolarizzante denominata INCM (Shalinsky, Magistretti et al., 2002). La INCM è una corrente cationica mista (condotta cioè sia dal sodio che dal potassio) che, oltre a dipendere dalla stimolazione di recettori muscarinici per la sua induzione, presenta proprietà modulatorie estremamente interessanti: essa è infatti potenziata da aumenti della concentrazione intracellulare del calcio che non superino un certo limite; ma viene spenta da ulteriori aumenti della concentrazione del calcio (Magistretti et al., 2004). Si realizzano in questo modo meccanismi attività-dipendenti di feed-back sia positivo che negativo, tali da sostenere scariche postume ed eventualmente autolimitarle in presenza di stimolazione colinergica. I futuri sviluppi di questi studi includono l’analisi delle basi di singolo canale della INCM, la caratterizzazione delle vie di trasduzione del segnale responsabili della sua attivazione, l’indagine dei meccanismi molecolari di modulazione dalla corrente, e la determinazione dei correlati molecolari dei sottostanti canali. Elementi indiretti suggeriscono che la INCM potrebbe essere sostenuta da canali appartenenti alla famiglia TRP. Verrà quindi studiato il possibile rapporto fra INCM e canali TRP nei neuroni della corteccia entorinale.

Pubblicazioni citate

Castelli, L., Biella, G., Toselli, M. & Magistretti, J. (2007) Resurgent Na⁺ current in pyramidal neurones of rat perirhinal cortex layer II: Axonal location of channels and contribution to depolarising drive during repetitive firing. Journal of Physiology 582, 1179-1193.

Castelli, L., Nigro, M. J. & Magistretti, J. (2007) Analysis of resurgent sodium-current expression in rat parahippocampal cortices and hippocampal formation. Brain Research 1163, 44-55.

Castelli, L., Tanzi, F., Taglietti, V. & Magistretti, J. (2003) Cu²⁺, Co²⁺, and Mn²⁺ modify the gating kinetics of high-voltage-activated Ca2+ channels in rat palaeocortical neurons. Journal of Membrane Biology 195, 121-136.

Dickson, C. T., Magistretti, J., Shalinsky, M. H., Fransén, E., Hasselmo, M. & Alonso, A. (2000) Properties and role of Ih in the pacing of subthreshold oscillations in entorhinal cortex layer II neurons. Journal of Neurophysiology 83, 2562-2579.

Diwakar, S., Magistretti, J., Goldfarb, M., Naldi, G. & D'Angelo, E. (2009) Axonal Na⁺ channels ensure fast spike activation and back-propagation in cerebellar granule cells. Journal of Neurophysiology 501, 519-532.

Fransén, E., Alonso, A. A., Dickson, C. T., Magistretti, J. & Hasselmo, M. E. (2004) Ionic mechanisms in the generation of subthreshold oscillations and action potential clustering in entorhinal layer II stellate neurons. Hippocampus 14, 368-384.

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Magistretti, J. & Alonso, A. (2007) Multiple conductance substates in pharmacologically untreated Na⁺ channels generating persistent openings in rat entorhinal cortex neurons. Journal of Membrane Biology 214, 165-180.

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Magistretti, J., Castelli, L., Forti, L. & D'Angelo, E. (2006) Kinetic and functional analysis of transient, persistent, and resurgent sodium currents in rat cerebellar granule cells in situ: an electrophysiological and modelling study. Journal of Physiology 573.1, 83-106.

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Magistretti, J., Ma, L., Shalinsky, M. H., Lin, W., Klink, R. & Alonso, A. (2004) Spike patterning by Ca²⁺-dependent regulation of a muscarinic cation current in entorhinal cortex layer-II neurons. Journal of Neurophysiology 92, 1644-1657.

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Magistretti, J., Ragsdale, D. S. & Alonso, A. (2003b) Kinetic diversity of single-channel burst openings underlying persistent Na⁺ current in entorhinal cortex neurons. Biophysical Journal 85, 3019-3034.

Nigro, M. J., Perin, P. & Magistretti, J. (2011) Differential effects of Zn²⁺ on activation, deactivation, and inactivation kinetics in neuronal voltage-gated Na⁺ channels. Pflügers Archiv 462, 331-347.

Osorio, N., Cathala, L., Meisler, M. H., Crest, M., Magistretti, J., & Delmas, P. (2010) Persistent Nav1.6 current at axon initial segments tunes spike timing of cerebellar granule cells. Journal of Physiology 588, 651-669.

Raman, I. M. & Bean, B. P. (1997) Resurgent sodium current and action potential formation in dissociated cerebellar Purkinje neurons. Journal of Neuroscience 17, 4517-4526.

Shalinsky, M. H., Magistretti, J., Ma, L. & Alonso, A. (2002) Muscarinic activation of a cation current and associated current noise in entorhinal-cortex layer-II neurons. Journal of Neurophysiology 88, 1197-1211.