La Ricerca
Meccanismi
biochimici dell'attivazione piastrinica (ENGLISH)
Studiosi partecipanti alla ricerca
Cesare Balduini, Mauro
Torti, Ilaria Canobbio, Gianni Guidetti, Silvia Catricalà, Lina Cipolla,
Alessandra Consonni
Breve descrizione della ricerca
La ricerca che ormai da
diversi anni viene condotta da questo gruppo è indirizzata allo studio dei
meccanismi biochimici che controllano la funzionalità piastrinica. Tale problematica, oltre che rivestire un notevole interesse scientifico di base, ha anche implicazioni applicative di grande rilievo, in quanto è ben noto che le patologie tromboemolitiche sono in larga misura correlabili con alterazioni dell'equilibrio funzionale delle piastrine conseguenti a lesioni di diverso tipo. Appare evidente che l'approfondimento delle conoscenze sui meccanismi di regolazione dell'attivazione piastrinica potrà consentire di individuare nuove possibilità di interventi terapeutici e preventivi. La nostra ricerca attuale è distinta in tre progetti.
Attivazione piastrinica promossa da adesione
mediata da integrina a2b1
Questo
progetto di ricerca è volto a caratterizzare i meccanismi di attivazione
piastrinica mediata da adesione a ligandi dell’integrina a2b1. In particolare la
nostra attenzione è focalizzata sulla via di trasduzione del segnale di tipo inside-out
implicata nell’attivazione dell’integrina aIIbb3. Abbiamo potuto
osservare che l’adesione piastrinica a diversi ligandi specifici per
l’integrina a2b1 è in grado di
promuovere l’attivazione dell’integrina aIIbb3 ed il conseguente
legame del fibrinogeno alle piastrine adese. Tale segnalazione tra le
integrine è strettamente dipendente dall’attivazione della fosfolipasi Cg2 e dalla successiva
attivazione della GTPasi a basso peso molecolare Rap1b. Recenti risultati
suggeriscono che l’attivazione della fosfolipasi Cg2 mediata dall’integrina a2b1 possa essere regolata da
una via di segnalazione diversa da quella tipicamente implicata
nell’attivazione delle isoforme g della
fosfolipasi C mediata da altri recettori piastrinici. Tale via di segnalazione
è ancora poco caratterizzata, ma risultati preliminari indicano che possa
esistere una duplice regolazione mediata indipendentemente da tirosin chinasi
appartenti alla famiglia Src e dalla GTPasi Rac.
Analisi dell’espressione e del metabolismo di
APP in piastrine umane
L’anormale
metabolismo della proteina precursore dell’amiloide (APP) è considerato tra
le principali cause dell’insorgenza della malattia di Alzheimer, dovuta
all’accumulo del peptide amiloidogenico Ab nel sistema nervoso sotto
forma di placche neuritiche che influenzano negativamente le funzioni neuronali.
Le piastrine esprimono APP e le secretasi coinvolte nel suo metabolismo. Questo
progetto di ricerca è volto ad indagare in modo approfondito l’espressione di
APP in piastrine di individui sani ed il suo metabolismo in seguito alla
stimolazione con diversi agonisti piastrinici in modo da caratterizzare i
meccanismi di segnalazione intracellulare che portano alla formazione e accumulo
di Ab. Lo studio verrà quindi esteso a pazienti affetti
da morbo di Alzheimer.
Meccanismo di segnalazione mediata dal recettore
purinergico P2Y12 in piastrine umane
Le
piastrine umane presentano sulla loro superficie tre recettori purinergici: il
recettore ionotropo P2X1, un canale per lo ione calcio, e i recettori
metabotropici P2Y1 e P2Y12 entrambi a sette domini transmembrana.
L’attivazione del recettore P2Y12, bersaglio di farmaci antitrombotici,
utilizzati nella profilassi del reinfarto cardiaco, è necessaria per garantire
una completa ed irreversibile aggregazione piastrinica. Lo studio del meccanismo
con cui il recettore purinergico P2Y12 trasduce segnali all’interno della
cellula e modula l’aggregazione piastrinica è da anni oggetto di studio nel
nostro laboratorio. La nostra attenzione è ora rivolta in particolare al
meccanismo di attivazione della protein chinasi C (PKC) in seguito a
stimolazione dei recettori P2Y in piastrine umane. Inoltre un ulteriore studio
verrà condotto su cellule 1321N1 di astrocitoma umane che esprimono i recettori
P2Y1 e P2Y12. Tale studio può risultare di notevole importanza per comprendere
al meglio i vantaggi e i limiti di farmaci in grado di agire su tale recettore.
Finanziamenti della ricerca
PRIN, MURST, CNR, FAR, Progetto di Ateneo, CARIPLO,
Telethon.
Pubblicazioni triennio 2006- 2009
Paganini S, Guidetti GF,
Catricala S, Trionfini P, Panelli S, Balduini C, Torti M.
Identification and biochemical characterization of Rap2C, a new member of the
Rap family of small GTP-binding proteins.
Biochimie, 88:285–295, 2006.
Canobbio I, Stefanini L,
Guidetti GF, Balduini C, Torti M.
A new role for FcgIIA in the potentiation of human
platelet activation induced by weak stimulation.
Cell Signal, 18:861–870, 2006.
Greco F, Ciana A, Pietra D, Balduini C, Minetti G, Torti M.
Rap2, but not Rap1 GTPase is expressed in human red blood cells and is involved
in vesiculation
Biochim
Biophys Acta, 1763:330–335, 2006.
Bernardi B, Guidetti GF,
Campus F, Crittenden JR, Graybiel AM, Balduini C, Torti M.
The small GTPase Rap1b regulates the cross-talk between platelet integrin a2b1
and integrin aIIbb3.
Blood, 107:2728–2735, 2006.
Noris P,
Guidetti GF, Conti V, Ceresa IF, Di Pumpo M, Pecci A, Torti M, Savoia A,
Balduini CL.
Autosomal
dominant thrombocytopenias with reduced expression of glycoprotein Ia.
Thromb Haemost, 95:483-489, 2006.
Reineri S, Bertoni A, Sanna
E, Baldassarri S, Sarasso C, Zanfa M, Canobbio I, Torti M, Sinigaglia F.
Membrane lipid rafts coordinate estrogen-dependent signaling in human platelets.
Biochim Biophys Acta, 1773:273–278, 2007.
Mancini F, Rigacci S, Berti A, Balduini C, Torti M.
The low-molecular-weight phosphotyrosine phosphatase is a negative regulator of FcgRIIA-mediated cell activation.
Blood, 110:1871–1878, 2007.
Ghilotti M, Lova P, Balduini C, Torti M.
Epinephrine induces intracellular Ca2+ mobilization in thrombin-desensitized platelets: a role for GPIb-IX-V.
Platelets, 18:135–142, 2007.
Canobbio
I, Trionfini P, Guidetti GF, Balduini C, Torti M.
Targeting of the small GTPase Rap2b, but not Rap1b, to lipid rafts is promoted
by palmitoylation at Cys176 and Cys177 and is required for efficient protein
activation in human platelets.
Cell Signal, 20:1662-1670, 2008.
Guidetti
GF, Lova P, Bernardi B, Campus F, Baldanzi G, Graziani A, Balduini C, Torti M.
The Gi-coupled P2Y12 receptor regulates diacylglycerol-mediated signaling in
human platelets.
J Biol Chem, 283:28795-28805, 2008.
Guidetti
GF, Bernardi B, Consonni A, Rizzo P, Gruppi C, Balduini C, Torti M.
Integrin alpha2beta1 induces phosphorylation dependent and independent
activation of phospholipase Cgamma2 in platelets: role of Src kinase and Rac
GTPase.
J Thromb Haemost, in press PubMed PMID: 19422462, 2009.
^TOP
Biochimica
dell'eritrocita umano normale e patologico
(ENGLISH)
Studiosi partecipanti alla ricerca
Giampaolo Minetti, Annarita Ciana,
Cesare Achilli, Cesare Balduini
Breve
descrizione della ricerca
Durante l’invecchiamento in circolo gli eritrociti umani normali vanno
incontro a disidratazione, perdita di estensione di superficie e modificazioni
delle proprietà antigeniche della membrana, eventi che portano al
sequestro, dopo circa 120 giorni di vita,
dell’eritrocita senescente, probabilmente per un
meccanismo auto-immune con legame di auto-anticorpi diretti contro
neo-antigeni di superficie (anti- banda3, anti-a-galattosidi,
ed epitopi non ancora caratterizzati) e attivazione del complemento. È
verosimile che la diminuita estensione di superficie
dell’eritrocita vecchio sia dovuta a perdita di membrana per vescicolazione, un processo che può essere indotto in
vitro da vari trattamenti, tra cui l’attivazione del complemento. Tema della
nostra ricerca è lo studio del processo di
vescicolazione dell’eritrocita in varie condizioni sperimentali, durante
il quale, a livello molecolare,
rimodellamenti della struttura del doppio strato lipidico della membrana e
dell’intelaiatura proteica che lo sostiene, il membrano-scheletro (MS).
L’ancoraggio del MS alla membrana dipende da legami “verticali” tra la principale proteina integrale dell'eritrocita, la proteina della banda 3, e la spettrina, componente principale
del membrano-scheletro, mediato dalla proteina periferica anchirina, e tra la
glicoforina C e il complesso spettrina/proteina 4.1. Il nostro
studio è volto alla caratterizzazione delle varie componenti di queste
strutture in eritrociti umani normali, patologici e conservati. Inoltre
vogliamo approfondire lo studio del ruolo della fosforilazione in tirosina
della banda 3
e le implicazioni di questo fenomeno per la stabilità della membrana, lo stato redox della
cellula ed il
controllo del pH intracellulare (collaborazione con il
Prof. I.
Bernhardt, Saarland University). Una parte della ricerca
è volta a caratterizzare l’identità ed il ruolo delle proteine G monomeriche
nell’eritrocita in funzione dell’età cellulare e della stabilità di
membrana. Il gruppo ha condotto uno studio sulle proprietà degli eritrociti
conservati a scopo trasfusionale in diverse soluzioni additive, evidenziando le modificazioni che gli eritrociti subiscono in funzione dell’età
cellulare.
Gli
eritrociti sono dotati di vari sistemi, enzimatici e non, deputati a limitare e/o riparare i
fenomeni ossidativi a danno delle proteine e dei lipidi: glutatione (GSH), catalasi, superossido dismutasi,
GSH-reduttasi, GSH-perossidasi, GSH-S-transferasi e perossiredoxina, tuttavia non
risulta documentata la presenza di attività
enzimatiche capaci di ridurre i residui di metionina (Met) ossidati delle proteine. La
classe di enzimi con attività Met-solfossido-reduttasica (Msr) si è
andata arricchendo di nuovi membri negli ultimi anni. Abbiamo condotto una ricerca di Msr negli eritrociti umani, che sono risultati
tuttavia privi di tale attività enzimatica. Nel corso dello studio abbiamo
proposto un metodo di saggio di Msr che è stato accolto con favore e viene
impiegato correntemente. Inoltre, studiando le proprietà della Msr dei
granulociti neutrofili umani, abbiamo osservato la riduzione stereospecifica di uno degli stereoisomeri della
L-Met solfossido. Il nostro
sospetto originario che esistano in natura due classi di enzimi Msr con opposta
stereospecificità ha trovato ampie conferme in studi recenti. E' in corso la caratterizzazione del
corredo di Msr nelle cellule del sangue umano
Dal Marzo 2004 il gruppo è impegnato
nel progetto CellPROM del Sesto Programma Quadro (FP6) di finanziamenti dell'Unione Europea e che comprende l'Unità di ricerca dell'Università di Pavia insieme con altri 26 partner europei. Il progetto, concepito per integrare competenze nel campo delle nanotecnologie e della biologia cellulare, mira allo sviluppo di un dispositivo
per la riprogrammazione non invasiva di cellule su scala industriale, sfruttando
superfici nanostrutturate (Nanolandscapes).
Finanziamento della ricerca
MURST;
FAR; Fondi Comitato
Biotecnologie e Biologia Molecolare; Integrated Project CellPROM of the 6th Framework Programme
of the European Commission.
Pubblicazioni
più significative
Minetti G, Balduini C, Brovelli A.
Reduction of DABS-L-methionine-dl-sulfoxide by protein methionine sulfoxide reductase from polymorphonuclear leukocytes: stereospecificity towards the
l-sulfoxide.
Ital J Biochem, 43:273–283,
1994.
Minetti
G, Ciana A, Profumo A, Zappa M, Vercellati C, Zanella A,. Arduini A, Brovelli A.
Cell age-related monovalent cations content and density changes in stored human
erythrocytes
Biochim Biophys Acta, 1527:149–155, 2001.
Brovelli
A, Minetti G.
Red Cell Ageing.
In: Red Cell Membrane Transport in Health and Disease, I. Bernhardt, J.C. Ellory,
eds.,
Springer-Verlag, Berlin, pp 673–690 (chapter 29), 2003.
Minetti G, Ciana A.
New and old integral proteins of the human erythrocyte membrane.
Blood, 101:3751, 2003.
Minetti G, Ciana A, Balduini C.
Differential sorting of tyrosine kinases and phosphotyrosine phosphatases acting on band 3
during vesiculation of human erythrocytes.
Biochem J, 377:489–497,
2004.
Ciana A, Minetti G, Balduini C.
Phosphotyrosine phosphatases acting on band 3 in human erythrocytes of different ages:
PTP1B processing during cell ageing.
Bioelectrochemistry, 62:169–173,
2004.
Ciana A, Balduini C, Minetti G.
Detergent-resistant membranes in human erythrocytes and their connection to the membrane-skeleton.
J Biosci, 30:317–328,
2005.
Greco F, Ciana A, Pietra D, Balduini C, Minetti G, Torti M.
Rap2, but not Rap1 GTPase is expressed in human red blood cells and is involved
in vesiculation
Biochim Biophys Acta, 1763:330–335, 2006.
Arduini
A, Minetti G, Ciana A, Seppi C, Brovelli A, Profumo A, Vercellati C, Zappa C,
Zanella A, Dottori S, Bonomini M.
Cellular properties of human erythrocytes preserved in saline–adenine–glucose–mannitol in the
presence of L-carnitine
Am J Hematol, 82:31–40, 2007.
Achilli C, Ciana A, Rossi A, Balduini C, Minetti G.
Neutrophil granulocytes uniquely express, among human blood cells, high levels of Methionine-sulfoxide-reductase enzymes.
J Leukoc Biol, 83:181–189,
2008.
Crepaldi Domingues C, Ciana A, Buttafava A, Balduini C, de Paula E, Minetti G.
Resistance of human erythrocyte membranes to Triton X-100 and C12E8.
J Membr Biol, 227:39-48, 2009.
^TOP
Biochimica della
matrice extracellulare (ENGLISH)
Studiosi partecipanti alla ricerca
M. Enrica Tira, Ruggero Tenni, Cristian Gruppi.
Breve descrizione della ricerca
Il lavoro è indirizzato allo studio dell’interazione
dei piccoli proteoglicani ricchi in leucina con i collageni fibrillari; entrambe
le classi di molecole sono componenti essenziali della matrici extracellulari
dei tessuti connettivi.
Attualmente sono presi in esame tre proteoglicani a leucina, decorina, biglicano
e fibromodulina, che possiedono un’elevata omologia di sequenza del core
proteico, contenendo 10 motivi strutturali altamente conservati e che sono
sostituiti con catene di glicosaminoglicani diversi, condroitino /
dermatan solfato il primo ed il secondo e cheratan solfato il terzo.
Questi proteoglicani, estratti da tessuti connettivi (per es. tendine e
cartilagine) oppure di origine ricombinante, vengono caratterizzati e saggiati
per le loro capacità di legame con i collageni di tipo I e II.
Parallelamente sono stati preparati e caratterizzati (dal punto di vista
strutturale e termodinamico) i peptidi derivati dai collageni di tipo I e II per
digestione chimica con CNBr. I peptidi sono stati utilizzati in studi per
l’identificazione del sito di legame per i proteoglicani già citati. Uno
studio precedente ha saggiato le interazioni di decorina e fibromodulina verso
gli stessi peptidi modificati chimicamente (N-acetilazione ed
N-metilazione dei residui di Lys e Hyl).
Principali risultati conseguiti
Mediante l’utilizzo dei peptidi collagenici in saggi in
fase solida (ELISA) si è potuta dimostrare l’interazione del proteoglicano
decorina in due diversi siti sulla molecola collagenica di tipo I, una
all’estremità N- e una alla C-terminale della tripla elica collagenica,
mentre sembra esistere un solo sito di legame all’estremità N-terminale del
collagene di tipo II. La tripla elica collagenica è fondamentale per
l’instaurarsi del legame, che risulta essere di tipo ionico.
I collageni ed i peptidi modificati chimicamente sui residui carichi
positivamente di Lys e Hyl sono stati caratterizzati termodinamicamente, studi
che hanno messo in rilievo la necessità dei gruppi ionici nelle stabilità
della tripla elica.
Studi preliminari mostrano che anche fibromodulina e biglicano riconoscono gli
stessi peptidi collagenici riconosciuti da decorina, ma le caratteristiche e le
affinità del legame sono ancora in corso di definizione.
In un secondo momento collageni e peptidi chimicamente modificati sono stati
utilizzati per saggiare la capacità di legame verso i proteoglicani, che
risulta compromessa in assenza di cariche positive e modulata in presenza di una
modifica che non altera la carica netta del collagene o dei peptidi.
Finanziamenti della ricerca
M.U.R.S.T. 40% e 60%, C.N.R.; Progetto giovani
ricercatori
Pubblicazioni anni 2003-2007
Guidetti GF, Greco F, Bertoni A, Giudici C, Viola
M, Tenni R, Tira ME,
Balduini C,Torti M.
Platelet
interaction with CNBr peptides from type II collagen via integrin a2b1
Biochim Biophys Acta, 1640:43–51, 2003.
Giudici
C, Viola M, Tira ME, Forlino A, Tenni R.
Molecular stability of chemically modified collagen triple helices
FEBS Lett, 547:170–176, 2003.
Guidetti GF, Bartolini B, Bernardi B,
Tira ME, Berndt MC, Balduini C, Torti M.
Binding of von Willebrand factor to the small proteoglycan decorin.
FEBS Lett, 574:95–100, 2004.
Tenni R, Sonaggere M, Viola M,
Bartolini B, Tira ME, Rossi A, Orsini E, Ruggeri A, Ottani V.
Self-aggregation of fibrillar collagens I and II involves lysine side chains.
Micron, 37:640–647, 2006.
Raspanti M, Viola M, Sonaggere M, Tira ME, Tenni R.
Collagen fibril structure is affected by collagen concentration and decorin.
Biomacromolecules, 8:2087–2091, 2007.
Viola M, Bartolini B, Sonaggere M, Giudici C, Tenni R, Tira ME.
Fibromodulin interactions with type I and II collagens.
Connect Tissue Res, 48:141–148, 2007.
^TOP
Analisi funzionale di varianti enzimatiche associate ad eritroenzimopatie
(ENGLISH)
Responsabile della Ricerca:
Prof. Giovanna Valentini
Studiosi partecipanti alla ricerca
Dott. Laurent R. Chiarelli, Dott. Simone M. Morera.
Breve descrizione della ricerca
La ricerca svolta nel laboratorio è essenzialmente
indirizzata allo studio della correlazione fra struttura e funzione delle
proteine. Il gruppo di ricerca vanta una lunga esperienza nell'espressione,
purificazione e caratterizzazione biochimica di enzimi e nel protein
engineering. La principale linea di ricerca riguarda da un decennio enzimi
eritrocitari e le relative varianti patologiche che nell'uomo sono associate ad
anemia emolitica non sferocitica ereditaria. L'obiettivo dello studio è da un
lato quello di individuare le basi molecolari dei deficit enzimatici e trovare
una correlazione fra difetto molecolare e sintomi clinici, dall'altro quello di
definire il ruolo funzionale degli aminoacidi le cui sostituzioni sono
responsabili dell'insorgenza della malattia Gli enzimi di interesse sono
prodotti in laboratorio mediante le tecnologie dell'ingegneria genetica,
purificati all'omogeneità e caratterizzati mediante l'analisi delle proprietà
strutturali, cinetico-regolatorie e di termostabilità. Dal confronto delle
proprietà delle diverse varianti con quelle degli enzimi wild-type è possibile
determinare il tipo e l'entità delle alterazioni enzimatiche causate dalle
mutazioni geniche e risalire alle cause dei deficit enzimatici.
Lo studio iniziato con la caratterizzazione di 13 varianti patologiche della
piruvato cinasi (RPK), e proseguito nel tempo con l'analisi di tutte le varianti
enzimatiche della pirimidina 5'-nucleotidasi di tipo 1 (P5N1) (8 mutanti) e
della adenilato cinasi di tipo 1 (AK1) (5 mutanti). è attualmente rivolto alla
fosfoglicerato cinasi di tipo 1 (PGK1) e alle sue varianti (16 mutanti derivati
da mutazioni puntiformi).
I principali risultati, pubblicati su riviste internazionali con alto impatto
scientifico, indicano, in linea generale, che: a) l'entità delle alterazioni
enzimatiche osservata in laboratorio non sempre correla con l'attività residua
eritrocitaria dei pazienti; b) è difficile fare previsioni sugli effetti delle
mutazioni anche in presenza delle informazioni sulle strutture tridimensionali,
perchè non esiste sempre correlazione fra la natura e la localizzazione degli
aminoacidi sostituiti e il tipo di alterazione molecolare. La conoscenza delle
effettive alterazioni delle varianti patologiche possono essere di grande
ausilio ai medici per una più precisa diagnosi e per il counseling genetico.
Il gruppo ha rapporti di collaborazione con le seguenti istituzioni:
Divisione di Ematologia, IRCCS Ospedale Maggiore di Milano. Dipartimento
di Genetica e Microbiologia dell’Università di Pavia.
Pubblicazioni triennio 2005-2008
Chiarelli LR, Bianchi P, Fermo E, Galizzi A,
Iadarola P, Mattevi A, Zanella A, Valentini G.
Functional analysis of pyrimidine 5'-nucleotidase mutants causing nonspherocytic hemolytic anemia.
Blood,
105:3340-3345,
2005.
Fermo E, Bianchi P, Chiarelli LR, Cotton F, Vercellati C, Writzl K, Baker K, Hann I, Rodwell R, Valentini G, Zanella A.
Red cell pyruvate kinase deficiency: 17 new mutations of the PK-LR gene
Br J Haematol, 129:839-846, 2005
Zanella A, Fermo E, Bianchi P, Valentini G.
Red cell pyruvate kinase deficiency: molecular and clinical aspects.
Br J Haematol 130:11-25, 2005.
Azzalin A, Del Vecchio I, Chiarelli LR, Valentini G, Comincini S, Ferretti L.
Absence of Interaction between Doppel and GFAP, Grb2, PrPC Proteins in Human Tumor Astrocytic
Cells
Anticancer Res 25:4369-4374, 2005
Chiarelli LR, Fermo E, Zanella A, Valentini G.
Hereditary erythrocyte pyrimidine 5’-nucleotidase deficiency: A biochemical, genetic and clinical
overview.
Hematology, 11:67-72, 2006.
Chiarelli LR, Fermo E, Abrusci P, Bianchi P, Dellacasa CM, Galizzi A, Zanella A, Valentini G.
Two new mutations of the P5’N-1 gene found in Italian patients with hereditary hemolytic anemia: the molecular basis of the red cell enzyme
disorder.
Haematologica, 91:1244-1247, 2006.
Zanella A, Bianchi P, Fermo E, Valentini G.
Hereditary pyrimidine 5'-nucleotidase deficiency: from genetics to clinical
manifestations.
Br J Haematol, 133:113-123, 2006
Comincini S, Chiarelli LR, Zelini I, Del Vecchio I, Azzalin A, Arias A, Ferrara V, Rognoni P, Dipoto A, Nano R, Valentini G, Ferretti L.
Nuclear mRNA retention and aberrant doppel protein expression in human astrocytic tumor
cells.
Oncology Report, 16:1325-1332, 2006.
Zanella A, Fermo E, Bianchi P, Chiarelli LR, Valentini G.
Pyruvate kinase deficiency: The genotype-phenotype association
Blood rev, 21:217-231, 2007.
Abrusci P, Chiarelli LR, Galizzi A, Fermo E, Bianchi P, Zanella A, Valentini G.
Erythrocyte adenylate kinase deficiency: characterization of recombinant mutant forms and relationship with nonspherocytic hemolytic
anemia.
Exp Hematol, 35:1182-1189, 2007.
Chiarelli LR, Morera SM, Galizzi A, Fermo E, Zanella A, Valentini G.
Molecular basis of pyrimidine 5′-nucleotidase deficiency caused by 3 newly identified missense mutations (c187T>C, c469G>C and c740T>C) and a tabulation of known
mutations.
Blood Cells Mol Dis, 40:295-301, 2008.
Cappelletti D, Chiarelli LR, Pasquetto MV, Stivala S, Valentini G, Scotti C.
Helicobacter pyloril-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent.
Biochem Biophys Res Commun, 377:1222-1226, 2008.
^TOP
Proteomica della BPCO (ENGLISH)
Studiosi partecipanti alla ricerca
Paolo Iadarola, Maurizia Valli, Simona Viglio, Fabio Ferrari, Marco Fumagalli
Breve descrizione della ricerca
La Broncopneumopatia Cronica Ostruttiva (BPCO) è un insieme di condizioni cliniche gravi caratterizzate da una persistente ostruzione delle vie respiratorie con conseguente rapido declino delle funzioni polmonari. Pur essendo molto diffusa, tale patologia presenta tuttora aspetti oscuri che ne limitano sia la prevenzione che il trattamento. Non essendo ancora stati identificati i meccanismi responsabili della sua insorgenza e progressione, è importante sviluppare ricerche che portino alla determinazione di nuovi biomarkers che possano essere inequivocabilmente correlati con la severità della malattia o con i suoi
outcomes. Il progetto di ricerca si propone di individuare tali biomarkers. I soggetti reclutati per questo studio, sia sulla base di linee-guida internazionali sia rispettando rigidi criteri di esclusione, vengono suddivisi in classi differenti a seguito di un’approfondita anamnesi respiratoria ed esame radiografico del torace. L’analisi delle proteine espresse da questi soggetti viene effettuata utilizzando apparecchiature ad alta risoluzione quali cromatografi liquidi ad alta prestazione accoppiati a spettrometria di massa/massa (HPLC-Q-TOF-MS/MS), 2-DE e spettrometria di massa SELDI-TOF. Una precisa comparazione di questi profili, effettuata impiegando analisi di calcolo probabilistico avanzato, consente di evidenziare le differenze significative tra di essi sulla base delle quali saranno isolate ed identificate le proteine alterate nei pazienti. La validità di tali markers nel fornire indicazioni per l’applicazione di terapie mirate viene valutata mediante studi longitudinali di variazioni di alcuni parametri clinici
(FEV1, etc).
Il gruppo
ha rapporti di collaborazione con le seguenti istituzioni: Department of Pulmonology, University Medical Center, Leiden, The
Netherlands; Georgetown University Proteomics Laboratory, Washington, DC, USA;
Laboratory of Biochemistry and Genetics, Institute of Respiratory Disease, IRCCS
San Matteo Hospital Foundation, Pavia; Dipartimento di Medicina Clinica e
Sperimentale, Università degli Studi di Ferrara; Dipartimento di Fisiopatologia
e Medicina Sperimentale, Università di Siena.
Principali
risultati conseguiti
L’analisi proteomica effettuata sui campioni di esalati condensati di pazienti affetti da enfisema polmonare ci ha permesso di dimostrare che il contenuto proteico di questi campioni è superiore a quello dei campioni prelevati dai soggetti sani. Avendo ipotizzato che questo potesse essere dovuto alla diversa condizione del tessuto polmonare si è proceduto all’identificazione delle proteine contenute nei campioni, allo scopo di individuare potenziali biomarcatori dello stato patologico.
Il tipo di
proteine più abbondanti e frequenti sono le citocheratine, in particolare la cytokeratin
1, la cytokeratin 9 e la cytokeratin 10. I nostri dati sono confortanti in quanto concordano
con i risultati ottenuti da un altro gruppo di ricerca su soggetti fumatori.
Questi ricercatori infatti hanno evidenziato un aumento della quantità di
citocheratina a livello degli esalati condensati provenienti da soggetti
fumatori rispetto a quelli di soggetti non fumatori.
L’aumento della concentrazione di citocheratina nei campioni relativi ai
pazienti AATD è stato interpretato come indice del danno tissutale che si
verifica nello stato patologico. Infatti, considerato che la manifestazione
clinica tipica di questi pazienti è l’enfisema caratterizzato da distruzione
dei setti alvolari e del parenchima, è ipotizzabile che vi sia quindi una
rottura delle cellule epiteliali con rilascio all’esterno del materiale
citoplasmatico e perciò anche della citocheratina. Poiché tale proteina è una
componente citoscheletrica tipica di questa tipologia di cellule, ciò spiega
allora la sua presenza a livello delle vie respiratorie. Considerati i dati
ottenuti e le considerazioni fatte in precedenza, si può quindi affermare che
la citocheratina possa rappresentare un potenziale biomarcatore dello stato
patologico. Non è ancora chiaro il motivo per cui, apparentemente, solo la
citocheratina, rispetto all’elevato numero di proteine del citoplasma, venga
veicolata all’esterno.
Sono state inoltre trovate proteine a basso peso molecolare che sono state
identificate come IFN-g, IL-2 e IL-15. Dal momento
che queste citochine vengono secreti dai leucociti al fine di mediare e di
regolare le risposte immunitarie ed infiammatorie sono da considerare importanti
biomarcatori indicativi dello stato infiammatorio che si instaura a livello
delle vie respiratorie.
L’identificazione di questi biomarkers rappresenta il primo gradino verso
l’interpretazione dei meccanismi multipli che possono portare all’insorgenza
e alla progressione della malattia.
Finanziamenti
delle ricerche
Programma
Strategico del Ministero della Sanità “Miglioramento della valutazione
diagnostica e prognostica della BPCO mediante nuovi indici funzionali e
biologici”; alfa1-International Registry; FAR.
Pubblicazioni triennio 2005-2008
Stolk J,
Veldhuisen B, Annovazzi L, Zanone C, Versteeg EM, van Kuppevelt TH,
Nieuwenhuizen W, Iadarola P, Berden JH, Luisetti M.
Short-term variability of biomarkers of proteinase activity in patients with
emphysema associated with type Z alpha-1-antitrypsin deficiency.
Respir Res, 7:20, 2006.
Viglio S,
Annovazzi L, Conti B, Genta I, Perugini P, Zanone C, Casado B, Cetta G, Iadarola
P.
The
role of emerging techniques in the investigation of prolidase deficiency: from
diagnosis to the development of a possible therapeutical approach.
J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci, 832:1–8, 2006.
Boschetto
P, Quintavalle S, Zeni E, Leprotti S, Potena A, Ballerin L, Papi A, Palladini G,
Luisetti M, Annovazzi L, Iadarola P, De Rosa E, Fabbri LM, Mapp CE.
Association
between markers of emphysema and more severe chronic obstructive pulmonary
disease.
Thorax, 61:1037–1042,
2006.
Di Poto C,
Iadarola P, Salvini R, Passadore I, Cereda C, Ceroni M, Bardoni AM.
Optimizing
separation efficiency of 2-DE procedures for visualization of different
superoxide dismutase forms in a cellular model of amyotrophic lateral sclerosis.
Electrophoresis, 28:4340–4347, 2007.
Di Poto
C, Iadarola P, Bardoni AM, Passadore I, Giorgetti S, Cereda C, Carrì MT, Ceroni
M, Salvini R.
2-DE and MALDI-TOF-MS for a comparative analysis of proteins expressed in
different cellular models of amyotrophic lateral sclerosis.
Electrophoresis,
28:4320–4329, 2007.
Casado B,
Iadarola P, Pannell LK, Luisetti M, Corsico A, Ansaldo E, Ferrarotti I,
Boschetto P, Baraniuk JN.
Protein
Expression in Sputum of Smokers and Chronic Obstructive Pulmonary Disease
Patients: A Pilot Study by CapLC-ESI-Q-TOF.
J Proteome Res, 6:4615–4623, 2007.
Viglio
S, Annovazzi L, Luisetti M, Stolk J, Casado B, Iadarola P.
Progress in the methodological strategies for the detection in real samples of
desmosine and isodesmosine, two biological markers of elastin degradation.
J Sep Sci, 30:202–213, 2007.
Iadarola
P, Ferrari F, Fumagalli M, Viglio S.
Determination of amino acids by micellar EKC: Recent advances in method
development and novel applications to different matrices.
Electrophoresis,
29:224–236, 2008.
Luisetti M, Ma S, Iadarola P, Stone PJ, Viglio S, Casado B, Lin YY, Snider GL, Turino GM.
Desmosine as a biomarker of elastin degradation in COPD: current status and future directions.
Eur Respir J, 32:1146-1157, 2008.
Casado
B, Iadarola P, Luisetti M, Kussmann M.
Proteomics-based diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease: the hunt
for new markers.
Expert Rev Proteomics, 5:693-704, 2008.
Fumagalli
M, Dolcini L, Sala A, Stolk J, Fregonese L, Ferrari F, Viglio S, Luisetti M,
Iadarola P.
Proteomic analysis of exhaled breath condensate from single patients with
pulmonary emphysema associated to alpha1-antitrypsin deficiency.
J Proteomics, 71:211-221, 2008.
Casado B,
Iadarola P, Pannell LK.
Preparation
of nasal secretions for proteome analysis.
Methods Mol Biol. 2008; 425: 77-87.
^TOP